链球菌提取物OK-432是一种细菌免疫强诱导剂，在日本已广泛用于肿瘤的辅助治疗。以C5TBL/6实验鼠做实验鼠做实验，人们发现OK-432可以促使复杂的胞质（运动），包括Th1胞质偏振的产物IL-12。以鼠类脾细胞分析IL-12，只发现了巨噬细胞和B细胞，以及另外一种高级的，由CD4+和CD8+细胞生成的IFN-r，而由于IL-12的原因，这个分析速度效缓了。人们在人体PBMCS。中发现了一种相似的胞质（运动）。由于OK-432作用。而生成的IFN-Y被抗IL-12Ab，抗IL-2Ab、抗TNF-aAb和抗IL-2Ra抑制。这说明，从Th1细胞产生的IFN-r是由上述胞质（运动）和IL-2Ra共同作用的结果。与另一种广泛应用的增强免疫杆状菌Calme He Guerin相比，OK-432更能促进IL-12和的IFN-r的生成。而且与BCG不同的是，由OK-432生成的TFN-r诱导质的机制与有粒巨噬细胞和IL-1几乎毫无关系。这说明OK-432是一种复杂胞质（运动）强诱导剂，特别是对于IL-12，OK-432可以通过引发Th1的主导状态从而使IL-12具有强肿瘤。

OK-432遇青霉素便不活泼，是链球菌族低毒性干化提取物。具有免疫调节能力和潜在治疗效用的OK-432已作为一种生物反应调节剂在前文中给与描述（1）。OK-432增加了中性白血球，巨噬细胞，淋巴细胞和NK细胞的活动，促进了包括IL-1，IL-2，IL-6，INF-和IFN-r在内的综合胞质（运动）（2-6）。OK-432被发现可以增强有细粒巨噬细胞（GM）3-CSF基因变化从而增加其抗肿瘤特性（7）。在

中，OK-432在日本已被广泛用于

的辅助治疗。（8）以及对食道癌，（9）对肠

，（11）和腹膜肿瘤的治疗中、（12）。有了OK-432的协助，并将之与化学疗法同时应用，免疫治疗便可提升癌病患者的成活率。尽管如此，OK-432准确的活动免疫机制仍未明确。

IL-12是一种近期定义的胞质，并被认为是其它胞质（运动）的主要调节物质，是T细胞的子集。IL-12是由于巨噬细胞对革兰式染色阴/阳性细菌和LPS的反应而生成。IL-12可以增加IFN-r的生成，并通过使Th反应偏振向Th1主导状态来减少IL-4的产生。IL-12作用于T细胞和HK细胞的作用包括增强细胞溶解力，就如同其对IPN-r的刺激诱导作用一样。通过IFN-r的产物CD8+T细胞和T细胞，，IL-12对鼠类肿瘤有巨大的抑制作用。

这篇文章分析了OK-432的活动免疫机制，并将其与另一个广泛应用的细菌免疫增强剂，杆状菌Calmeffe Guerin (BCG)来比较。人们发现OK-432是Th1主导状态反应和IL-12的主要诱导剂，而这之后在实验鼠的实验中也导致了IPN-r的生成。而且，由于OK-432活化了的Th1细胞中生成的最大量的IFN-r显示出与IL-12，IL-2和通过IL-2Rα的TNF-α的共同作用有关。

资料与方法

生物反应调节剂（BRMS）

OK-432（日本东京Chugai Pharmaceuticul）是A群链球菌冻干的产物，属第三类，Su株；与青霉素G在一起时不活跃。OK-432的浓度单位是Klinische EinheifCKE）。1KE的OK-432相当于o.1mg的干链球菌。

原类BCG（巴斯德菌下属株）以Middlebrwk TH9为培养基生成，在37℃持续晃动时，含5%BSA和0.05%Tween-80。Log phase BCG被用来刺激脾细胞。BCG中CFV的浓度用OD600来测定。（1.0V的OD600~2.5×107（FU/ml）。

实验用鼠

C57BL/6实验用鼠由Charles River实验室（维明顿，MA）提供。各项实验均采用了6至8周大的雌鼠。老鼠到达后，要被放入一个与病原体隔绝的容器中，并至少用一周时间来适应有规律的12小时白天，12小时黑夜的循环，之后才会被用于实验。

在vi+ro脾细胞培养物中

在24-well和96-well的组织结构培养皿中，每次实验取自3~5只实验用鼠的未分馏的脾细胞被培养出细胞密度为2×106脾细胞/ml的副本。（Corning, Corning, NY），外因鼠性重组细胞质，细胞质Abs与OK-432或BCG一道与脾细胞在RMI1640中，与10%FBS一起共同培养。经过37℃，同5%的二氧化碳在湿润的细菌培养器中培养24小时，并经过批量测试前72小时的-70℃储存，调节过的培养基处于离心分离状态。之后做IL-12，TNF-a分析/实验24小时，并通过ELISA做IL-2，IL-4，IL-6，IL-10；GM-CSF和TNFr分析实验72小时。

脾免疫细胞子集的选择

由于为巨噬细胞大量生成的脾细胞被分于两部放于塑料组织培养皿中，在37℃的条件下培养2小时。再以两条尼龙毛料柱将B细胞大部分隔为连续几块。余下的无附着力的细胞，通过高磁性梯度分离柱按阴、阳性分离。（MACS；Miltenyi Biofec公司，Auburn, CA）（23）简言之，脾细胞表面聚集了ABS的下属子集，也正是优良顺磁性MACS微小珠粒因高磁性梯度分离而合拢。从Abs到CD Ags应依如下顺序：B220，B细胞；CD4T协助细胞；CD8，T毒性/相抑细胞，NK1.1，NK细胞。这个程序的可靠性由流式细胞计数决定。

以FACS分析后发现孤立的巨噬细胞中CD4+T，CD8+T和B细胞分别为98，98，90；纯度均为97%，NK细胞只占未分解细胞的不到2%。每个分离部分的细胞（2×105）都与OK-432（0.001KE/ml在96-well的组织培养皿中放置72小时，调节培养好的培养基按以上提及的方法进行分析。

OK-432老鼠活体实验

给实验用鼠腹膜注射0.2ml（1KE/mouse）的在HBSS（生命科学技术Granel Island,纽约）中稀释到浓度为5KE/ml的OK-432。之后，分别于3，6，12和24小时将它们分别杀死。某些实验中对老鼠预先做了1KE/mouse，OK-432的注射，再于6小时后将其杀死。这些老鼠的血浆都于-70℃状态保存到ELISA分析实验用。

人体PBM（外固血单核细胞）培养。从还未迎受BCG免疫治疗的膀胱癌患者取出的外固血样保持在肝素化了的直空容器中。PBMC细胞以取聚蔗糖 泛影葡胺密度倾斜排列。（Lymphoprep; Nyegaarcl and co.,奥斯陆，挪威）。2×106细胞/ml，DBMC放置于RPMI1640中，再加上10%FBS于各别浓度的OK-432或BCG培养72小时。之后，将培养基依上边提及的方法做实验分析。

Cytokine-specific ElisAs were performecl usihg a sandmizh fomat.对不同ELISA而言，分析最低限从5-50pg/ml不等。老鼠的IL-2和IL-6，以及人类与老鼠的IL-4和GM-CSF，和老鼠的IFN-r中的重组胞质都由Phar Migen（圣.迭哥CA）留作商业用途而保存。人类IL-2，IFN-r以及人类与老鼠的IL-10，TNFa的重组由Genzyme (Cambridge MA)处获得。人类与老鼠的IL-12重组由Genetics Institue, Inc (Cambridge MA)小康憾提供。为ELISA而进行的ABS分析和配对被依下列顺序（内容）进行：IL-2（鼠），IL-4（人和鼠），IL-6（鼠），IL-10（人和鼠），GM-CSF（人和鼠），TNF-a（人和鼠），IL-2（鼠），IL-12（人）和IFN-Y（人和鼠）。

中和胞质Abs

研究中所用Abs分别为：多克隆性绵羊抗-mIL-12Ab（Genetic Institute提供）；多克隆性兔子抗-mIL-2Ab(Collaborative Biomeclical Prochets, Bedford,MA)；单克隆老鼠抗-mIL-2R(a-chain/p55, B-chian/p75)；抗-mIL-6Ab，抗-mTNF-aAb和抗-mI-IRAB（PharMigen）；山羊多克隆性抗-mIL-10Ab，抗-mGM-CSFAb（RED SYS， Minneapolis MN）和老鼠单克隆性抗-mIFN-a Ab(Lee Biomolecular，圣.迭哥，CA)。

资料分析

上述所有分析检验误差为±ISD。资料分析由研究生完成，所有资料分析为statuarks资料软件（cricke+software.znc费一域、PA），所有实验均在相同条件下做三次并取得了相同的结果。数据不源于典型，有代表性的实验。

结果

OK-432激活的脾细胞胞质（运动）分析

当鼠脾细胞被OK-432激活时，IL-6，IL-10，IL-12，IFN-r和TNF-a（Tasle.l）也同时受到很大诱发性刺激。这一切都发生在培养基中。所有这些因OK-432而生的胞质活动都遵循一条抛物曲线。能刺激IL-12和IFN-Y的是从2×106cell/ml脾细胞中取出的浓度为0.01KE/ml的OK-432（1mg/ml）而对IL-6，IL-10和TNF-a而言，浓度为0.1KE/ml的OK-432才是最理想的。在BCG的研究中，也发现了十分相似的反应抛物曲线。有趣的是，虽然，在被OK-432激活的培养基中发现了一小部分IL-2，事实上浓度最低为0.01KE/ml的OK-432相对抑制脾细胞的活动。GM-CSF受OK-432的影响很少，而在这些分析实验中根本未发现IL-4，（敏感实验，10pg/ml）。

若将BCG发挥作用的最佳浓度用于OK-432，则后者对IL-10，IL-12和IFN-Y（Fig.1）都有着更强的影响。由OK-432激活的脾细胞所注的IFN-Y较由BCG激活产生的为多（0~100%）。另一方面，BCG对IL-6和GM-CSF产生更强的作用，而其对TNF-a的影响与OK-432相同。由OK-432激活的脾细胞产生的IL-2少于由BCG激活产生的。无论用OK-432还是用BCG的培养基中的IL-2在实验后都会减少，特别是与未经处理的相比，在所有分析实验中都未发现IL-4。

虑到时间因素的影响，IL-12和TNF-a在培养初期12-24小时内便率先增大，而IL-6，IL-10，GM-CSF和IFN-Y则于24小时后才到最大值。（Tasle Ⅱ）IFN-Y的最高浓度要在120小时左右才会出现。

部分独立细胞活动分析

用相对纯的免疫细胞，我们就可以决定被OK-432激活的细胞质的主要来源。（Table Ⅲ）在OK-432刺激后，所有脾细胞将产生全部细胞质（运动）。被激活的巨噬细胞产生IL-6，IL-10，IL-12和TNF-a，但不包含IFN-Y。在用纯化后的B细胞时也发现了相似的结果，但细胞质（运动）相对减少了。在被OK-432激活的T细胞培养基中发现的IL-10只比没经过培养进增加了一占领，但却总比培养基中含巨噬细胞时的少。向巨噬细胞培养基中进一步加入抗-IFN-TAb并不影响IL-12的被激活。OK-432无法直接在提纯后的CD4+或CD8+T细胞中作用于IFN-Y。其实，IFN-Y生成于CD4+或CD8+T细胞与巨噬细胞或B细胞的混合物中，而非只有纯化的rmIL-12。

治体胞质（运动）分析

在治实验用鼠身上注射OK-432后，IL-12有片刻增长，表现为6小时后血浆增加到3000pg/ml，但止后又飞速下降。（Tasle TV）血浆IPN-Y也历经片刻上升，（于24小时止）之后下降得更快，达到更低水平。给预定处理过的小鼠加注射OK-432，血浆IL-12和IFN-Y分别于6小时后升到4000pg/ml和24000pg/ml。

由OK-432激活的在人体PBCMS细胞胞质分析：人体PBMC培养基中，胞质活动图与鼠类脾细胞的十分相似。（Table V）IL-10，IL-12，GM-CSF，TNF-a和TNF-r都呈现出反应抛物曲线，只有IL-2，在OK-432作用下的反应图与其它的相反。因为在鼠类脾细胞中，OK-432对IL-12的IFN-Y的影响作用强于BCG，而对IL-10和TNFα而言，两者相同。

由于胞质Abs对IFN-r的影响抗IL-12AB的内部中和能力，它对被OK-432作用的脾细胞所产生的IFN一个有明显影响。（Fig.2a）MIL-10的重组对由OK-432影响的脾细胞产生的IL-12和IFN-r有明显地抑制作用。IL-10也同样阻碍IL-6，GM-CSF和TNF-α，这些脾细胞的产物。

对于受OK-432作用的脾细胞，抗-IL-2和抗-TNF-α分别抑制40%和50%的IPN-Y，但对IL-12无影响。（Fig3a）抗-IL-6和GM-CSFAb对IFN-Y和IL-12均无作用（由OK-432作用而生成），而抗-IL-IRAb对激活IFN-Y有很少作用。中和Ab到IFN-Y本身并不影响IL-12的激活。

对由BCG激活的脾细胞而言，Ab和IL-12对IFN-r的影响最大。（Fig3b）由BCG作用而生成的IFN-Y被抗-IL-2抑制了70%，被抗-TNF-aAb抑制了30%，被抗-IL-1rab抑制了40%，被抗-GM-CSFAb抑制了30%，Ab和IFN-Y抑制了IL-12的50%，奇怪的是，当用抗-GM-CSFAb时，IL-12内部增加了2层，这表示GM-CSF利用了IL-12。

IL-2Rabs对由OK-432激活脾细胞而产生的胞质运动的影响。

抗-IL-2RaAb抑制由OK-432作用TIFN-Y的生成，而抗-IL-2RBAb的作用却微乎其微。（Fig.4）抗-IL-2R（a,β）Abs并不阻碍IL-12的生成。当被OK-432激活的脾细胞与抗-IL-12，抗-IL-2R（a,β）或IL-10一起培养时，IL-2的浓度大幅度提高。这一结果经IL-2-depenelent CTLL-2细胞生物鉴定。

缘于外因的IFN-Y生成的增长。

对于由OK-432激活的脾细胞而言，外因rmIL-2会引发IFN-Y生成的增加。（Fig,5）相反，rmIL-12，rmgM-CSF，rmTNF-a或mIL-6不会引发IFN-Y的增长。对由BCG激活的脾细胞而言，外加rmIL-2，rmIL-12和rmGM-CSF会引发IFN-Y的相当数量的增加。而rmTNF-a或rmIL-6并不会引起同样的作用。

讨论分析

在日本，使用链球菌制剂OK-432作为

病人的治疗手段已有二十多年的临床经验。事实证明，给肺癌患者和胃肠癌患者系统的注入OK-432并结合有效的化学疗法增强病人的宿主免疫反应。将OK-432反复地注入肿瘤区，比如将其注入腹膜腔用以治疗恶性腹水或是用于肠胃癌症进行内诊镜检查，不论是以局部还是直接的方式，都能有效地促使局部的抗癌免疫反应形成。注入OK-432后，病人往往出现高烧现象，但只要使用退热剂就能很好地控制病情。OK-432的高效能还可归功于T细胞和NK细胞的活化作用，或是巨噬细胞引发的细胞毒性，有时源于多细胞分裂动力素的分裂作用。有资料显示，OK-432还是一种多细胞分裂动力素的诱导体，其IL-2在ND细胞的活化作用和IFN-Y分裂过程中起着至关重要的作用。最近，细胞分裂动力素研究的进展使得我们能够从细胞分裂动力素入手来研究OK-432的结构方式。

OK-432是一种强有力的IL-12诱导体这一发现使正在不断扩充的具有类似诱导特征的细菌属因子系列更加完备；LPS，热能固定的葡萄球菌Aureus Conan亚变种1，分枝杆菌结核杆菌以及BCG都属于这一系列。而根据福吉磨托（T.Fujimoto之音译名）尚未发表的实验结果，OK-432的IL-12诱导作用要强于BCC，SAC-1和LPS。我们研究的结果表明，大部分由OK-432诱导生成的IL-12都来源于巨噬细胞，来源于B细胞的则要少得多，这也表明APC在促进小细胞免疫反应形成方面的另一关键作用。实际上IFN-Y只能由CD4+或CD8+T与巨噬细胞或B细胞的混合物制造出来，因此替换外生的rmIL-12并不能达到同样的效果。这说明APC-S和T细胞的相互作用需要IFN-Y来反映。有趣的是，尽管IFN-Y已被认为是可以刺激IL-12的生成而且可能在其最初生成阶段是必须的，但由于OK-432作用而生成的IL-12不会受中和抗-IFN-YAb的影响。另人信服的是，很可能这些APCs已经过IFN-Y的内部处理或某些Ags会跳过ZFN-Y而直接为IL-12的激活：

在这次研究中，OK-432的胞质激活性与另一种广泛应用的免疫增强剂BCG做了直接比较。BCG的免疫增强性已在某些人类癌症病与的治疗中得到运用，包括早期膀胱癌（30）和毒性肿瘤（31）。人们最近发现BCG刺激Th1偏振反应可由IL-12和IFN-Y显现出来，（28、32）而且，BCG通过IFN-Y阻碍肿瘤生长的作用已被发现。（24）

虽然具有相似的刺激IL-6，IL-10，IL-12，TNF-a和TFN-Y的能力，但OK-432对IL-12，TFN-Y和IL-10的影响远大于BCG。相反的，BCG对GM-CSF和IL-6的作用较大。对BCG和OK-432来讲，IFN-Y的生成大量为IL-12-，而较少范围的IL-2-，TNF-a-和IL-1-depenclent。但可能因为IL-12的生成缘OK-432的渗入作用而非BCG，内生rmIL-12对进一步提高因BCG作用而生成的IFN-Y的数量有很大作用，而对由OK-432作用而生成的2FN-Y而言则没有。相似的是，内生IFN-Y提高2H2的生成量（缘于BCG而生成的IL-12），而对于由OK-432生成的IL-12则无作用。不同的是，内生rmIL-2对OK-432和BCG作用后的结果均有很大影响，而rmINF-a对任何一种均无作用。另外一点值得说明的OK-432和BCG的不同体现于GM-CSF上。无论内生或外生的GM-CSF对BCG对IFN-Y的作用均有很大影响，但对OK-432对IFN-Y的影响几乎不存在。GM-CSF被发现能增加巨噬细胞IL-12的生成，而这对BRMs而言很有判断力，比较BCG对IL-12的作用就很有限。但我们发现抗-GM-CSFAb总导致IFN-Y的下降（由BCG作用而生成的）。但IL-12并未下降这说明IL-12不受影响。

IL-2对OK-432和BCG作用生成的IL-12的促进作用，在Ag的表现过程中得到了很好的体现。报名中所有数据均来自活体老鼠，而这些老鼠的提供者们几乎无处不在。除此以外，BRMs和IFN-Y的反应对IL-2也有一定的关系。很值得提出的是在与其它方法折的比较中，用IL-2测试的结果与其它的正好相反，例如IL-2最低组IFN-Y却为最高值。所有的观察发现，所阻止IFN-Y的综合体构缘于IL-2的上升，看来由于OK-432和BCG而生成的IL-2很快便由于IL-12和IFN-Y的生成消耗了。由于IFN-Y的一各未知的元素可以刺激IL-2的生成。无论是什么解释，在内生rmIL-2对IFN-Y生成的增长促进作用中，IL-2的生成或显现出与OK-432和BCG无太大联系。人们早已发现IL-2和IL-12可以通过稳定IFN-Y  mRNA（33）来增加IFN-Y的生成，或对IL-2R的Th1的克隆（34）。显而易见，在临床反复用过的这两种BRMs可以刺激T细胞并诱导IL-2的生成。

有趣的是，由于OK-432或BCG而引起的IFN-Y的生成在某种程度上受抗-IL-2Ab或抗-IL-2RaAb的阻碍，但抗-IL-2R/Bab对它无作用。这个对比反映出IFN-Y生成的NK细胞受到抗-IL-15Ab和抗-IL-2RBAb（35）的抑制。在OK-432或BCG的作用下，T细胞对于IFN-Y的生成所起的作用运大于NK细胞。我们的结论仍需进一步调查取证：但通过IFN-Y由于T细胞作用而激活，我们可以通OK-432这个很好的例子来研究IL-2，IL-2R和IL-12之间的关系。

由于OK-432作用于脾细胞而产生后果的时间图和胞质活动很好地说明了胞质内部协调和控制IFN-Y的生成。4类主要巨噬细胞中的三种（IL-6，IL-12，和TNF-a）和生成增大的较早，而IL-10则相对迟缓。相似的，这三种巨噬胞质的最佳受刺激点也比IL-10低的多。因而，IL-12/TNF-a的独立刺激作用经IFN-Y，CD4+和CD8+的影响速度较慢，但很稳定，并与之前的结果一样（36）。至少在由于OK-432作用的情况下，中和抗-IL-10Ab对IL-12和IFN-Y的影响失败，更说明了内生IL-10生成的太少太晚。CT.Fvjimoto and M.A.Odonnell，urpublished Obsewations).这些观察结果表明，在一般情况下OK-432自然就是稳定的，很强的1类T细胞区别诱导剂。但可能在higw Ag load或持续刺激下，累积的ＩＬ－１２的反调作用可能会控制和制止意外的效果，如破坏组织免疫反应等。事实在上，我们已发现刺激IL-10会限制IL-12的本身作用。我们自己的一项观察结果更加表明了这一点，中和IL-12Ab降低了由OK-432刺激脾细胞后内主IL-10的生成。（T.Fujimoto,nnpuslishtd Obstrucitions）。以OK-432为例，巨噬细胞通过控制IL-10的生成来给于IFN-Y综合体巨大的影响。

FN-r的阻止肿瘤生长特性可以抑制多种恶性肿瘤。（41，42）由于某种免疫增强剂的作用而内生的IFN-Y也会对肿瘤有直接或间接的影响，同时对后部免疫系统环境也有一定的作用，包括改善细胞表面主要组织的适应性Ags，微小粒子的粘连，和下垂分离诱导剂如Fas和TNF-a神经未梢。（43，44）人们还发现IFN-Y能刺激一系列的会引发炎症的物质，比如CXC化学质IP-10（22）。由于OK-432作用而生成的IFN-Y在抗-IL-12Ab的作用下会增加90%，但外生IL-12的重组对它则无效果。这说明缘于OK-432作用而生成的内生IL-12是随后生成IFN-Y不可缺少的，也就是说OK-432已激活了足够多水平的内生IL-12来促使最大限度的IFN-Y的生成。在用OK-432作过预期处理的活体老鼠身上，血浆中的IFN-Y也大幅增加。IL-12被赋予了抗肿瘤的特性，这合理地说明了OK-432通过IL-12和IFN-Y的生成引发了其抗肿瘤的功效。

总的讲，这篇报告说明了链球菌诱导剂OK-432是一种多细胞诱导剂，更具体地讲，OK-432诱发刺激IL-12，并减轻了T细胞的偏振而产生的主导状态。而且，很可能是通过IL-2Ra，OK-432与IL-12，IL-2和TNF-a共同作用，从而引发IFN-Y的大量生成